Alcune anomalie geniche possono dare origine a errori nelle strutture proteiche

Linus Pauling pensava che le malattie umane riguardanti l''emoglobina, come l'anemia falciforme, possono essere ricondotte ad una variazione della struttura proteica della molecola di emoglobina. Per verificare la sua ipotesi si servì dell'elettroforesi, metodo per osservare il comportamento delle molecole dell'emoglobina di individui omozigoti non affette dalla malattia, di omozigoti recessivi con la malattia e di eterozigoti per l'allele dell'anemia falciforme, le quali, disciolte in una soluzione e sottoposte ad un debole campo elettrico, si comportano in maniere totalmente diverse. I risultati possono essere schematizzati in questo grafico:

L'RNA ha una struttura molecolare molto simile a quella del DNA

In che modo la disposizione delle basi azotate nel DNA può determinare la sequenza degli amminoacidi di una proteina?

A ciò interviene l'RNA o acido ribonucleico, il quale possiede alcune caratteristiche che lo differenziano dal DNA: 

Esso “traduce” le sequenze dei segmenti di DNA nelle esatte sequenze degli amminoacidi che determinano le varie strutture proteiche, soprattutto nel citosol. 

Dopo vari esperimenti si vide che esistono tre tipi di RNA che fungono da intermediari nella sintesi proteica dal DNA al citosol.

Mediante il processo di trascrizione viene sintetizzato l'RNA messaggero

Durante la fase iniziale, la RNA polimerasi riconosce delle strutture nucleotidiche del DNA (promotori) e si attacca alla catena tramite ad una proteina (fattore sigma); dopodiché il fattore sigma si stacca e l'RNA polimerasi scorre lungo la doppia elica del DNA, separando i due filamenti.

Nella fase di allungamento, utilizzando solamente uno dei due filamenti di DNA, il filamento di stampo, l'RNA polimerasi sintetizza il trascritto di mRNA, aggiungendo nucleotidi che sono presenti nella cellula sottoforma di nucleosidi trifosfati (NTP), i quali si aggiungono alla catena di RNA perdendo due gruppi fosfato; l'mRNA fabbricato è complementare al filamento di stampo, mentre è identico al filamento di DNA non utilizzato tranne che per la T al posto dell'U.

Il processo termina quando si incontrano delle strutture nucleotidiche (sequenze di arresto), bloccando così la trascrizione.

Questo processo è utile perché il DNA, essendo la copia matrice delle informazioni genetiche, viene utilizzato più volte, mentre l'mRNA deve trasportare il messaggio codificato dal DNA, attraversando il citoplasma della cellula e, quando il suo compito termina, si scompone per dare origine ad altre molecole.

La maturazione dell'mRNA avviene mediante lo splicing

Prima che la trascrizione sia completata, l'RNA messaggero aggiunge un nucleotide chiamato cappuccio (7-metilguanosina) all'estremità 5', tramite un processo denominato capping.

Dopodiché il pre-mRNA per diventare maturo deve sottoporsi ad un processo denominato splicing, attraverso il quale avviene il taglio degli introni e la ricongiunzione degli esoni: per far ciò, interviene un grosso complesso molecolare chiamato spliceosoma, formato da subunità denominate snRNP (small nuclear Ribo-Nucleo-Protein), ovvero delle piccole riboproteine nucleari.

Negli esseri umani (non solo) il 70% dei geni è rielaborato in modi diversi (splicing alternativo), eliminando introni ed esoni in modo differenti, producendo diversi tipi di proteine.

Infine, dopo lo splicing, viene aggiunta una sequenza nucleotidica formata solamente da adenina, chiamata coda poli-A (conferisce stabilità al mRNA maturo, garantendone maggior durata nel citosol).

La decifrazione del codice genetico

Severo Ochoa

Il biochimico di origine spagnola Severo Ochoa aveva sviluppato (premio nobel per la medicina 1959) un metodo per sintetizzare un lungo filamento di DNA mediante l'unione di nucleotidi; con questo metodo aveva creato un filamento di RNA in provetta costituita da una sola base azotata, l'uracile, denominando così il filamento “poli-U”. 

Così due scienziati, il biochimico statunitense Marshall Warren Nirenberg e il tedesco Heinrich Matthaei, nel 

1961, prepararono 20 provette contenenti ciascuna ribosomi, ATP, enzimi e amminoacidi, ognuno dei quali, e uno solo, era marcato radioattivamente. In 19 provette non si produsse nessun polipeptide, ma nella restante, in cui era presente la fenilalanina radioattiva, si formarono catene polipeptidiche UUU. 

Esperimenti simili furono fatti nel corso del tempo da altri scienziati, cosicchè furono decifrati tutti i possibili codoni del RNA messaggero. Delle 64 combinazioni possibili di triplette, 3 sono segnali di arresto, mentre le restanti 61 codificano gli amminoacidi corrispondenti.

Ma come mai esistono 64 combinazioni possibili per codificare i venti amminoacidi?

Gli scienziati ebbero identificato l'mRNA come la copia di lavoro delle istruzioni genetiche che il DNA doveva eseguire per fabbricare le proteine, ma si chiesero anche come il DNA potesse codificarle. Le proteine contengono 20 amminoacidi differenti disposti linearmente, mentre il DNA e l'RNA contengono ciascuno 4 nucleotidi disposti linearmente in sequenze differenti. Se ciascun nucleotide codificasse un singolo amminoacido, allora le 4 basi azotate corrisponderebbero solamente a 4 amminoacidi. Se una sequenza di due nucleotidi codificasse invece un amminoacido, ci sarebbero 4² possibilità di risoluzione, ma gli amminoacidi sono ben 20. Perciò, si arrivò a scoprire che ad una sequenza di tre nucleotidi, corrispondeva un amminoacido, ottenendo 4³ possibilità di risoluzione, cioè 64. Ogni sequenza (tripletta) è definita codone.

Quando un amminoacido è decodificato da 4 triplette che differiscono solamente per l'ultimo nucleotide, il codice è detto degenerato.

Il codice genetico è identico per tutti gli esseri viventi sul pianeta terra, nel senso che se prendessimo una tripletta nucleotidica, essa traduce un amminoacido che è identico nell'uomo, ma anche in un fungo, oppure in un lichene...

L'unica eccezione sono i mitocondri, i quali contengono un proprio DNA, indipendente da quello nucleare, che viene trascritto in mRNA, sintetizzando proteine mitocondriali particolari.

Gli RNA ribosomiale e di trasporto svolgono la loro funzione nel citoplasma

La sintesi proteica è meno complessa nei procarioti, rispetto agli eucarioti, ma entrambi gli organismi

possiedono delle comunanze; una caratteristica fondamentale che
riguarda la trascrizione è che si svolge nel nucleo, mentre la sintesi proteica nel citoplasma, a differenza delle cellule procarioti.

La sintesi necessita innanzitutto di altri due tipi di RNA: quello ribosomiale (rRNA) e quello di trasporto (tRNA).

L'RNA ribosomiale è contenuto naturalmente nei ribosomi, formati per un terzo da proteine e per due terzi da RNA; essi sono costituiti da due subunità:

1. la subunità minore che possiede un sito di legame per l'RNA messaggero;
2. la subunità maggiore che possiede tre siti di legame per gli RNA di trasporto.

Robert Holley

L'RNA di trasporto (scoperto nel 1962 da Robert Holley)

traduce il linguaggio degli acidi nucleici in proteine, contenuto nelle cellule in più di 20 tipi diversi, almeno uno per ciascun amminoacido. Esso presenta una struttura a trifoglio, formata da una catena in direzione 5' – 3'. Questo filamento è formato da basi invariabili (ad esempio la sequenza finale CCA presso l'estremità 3') per tutti i tipi di tRNA, ma ne presenta anche di variabili:

1. un anticodone formato da tre nucleotidi variabili e complementari all'mRNA;
2. una regione che sintetizza un enzima chiamato amminoacil-tRNA sintetasi, il quale attira i specifici amminoacidi alle catene di RNA di trasporto, cosicché quest'ultimo può essere trasportato al sito di una formazione polipeptidica.

Il controllo genico nei eucarioti

Il controllo durante la trascrizione negli eucarioti presenta analogie e differenze con il sistema dei procarioti. Infatti in entrambi gli organismi agiscono le molecole effettrici, gli attivatori e i repressori che influenzano l'attività di codificazione dell'RNA polimerasi; mentre nelle DNA eucariote non esiste l'operone, perché ogni gene strutturale possiede un proprio sistema di controllo.

La cromatina (DNA + proteine) è in relazione col tasso di informazione genica che si vuole trasmettere; infatti può essere di due tipi, identificabili attraverso la colorazione:

1. l'eucromatina, ovvero la cromatina che risulta più dispersa, meno densa e che si colora debolmente. Essa si trova nell'interfase, dove permette l'accesso delle molecole di RNA polimerasi per permettere la trascrizione (perciò presenta una conformazione aperta);
2. l'eterocromatina, ovvero la cromatina maggiormente condensata, compatta e che si colora più intensamente. La cromatina si trova durante questo stato durante la divisione cellulare o nei centromeri ad esempio, inibendo l'attività di trascrizione (presentando perciò una conformazione chiusa).

Corpo di Barr

Murray Llewellyn Barr

La trascrizione può avvenire come si è visto solo se la cromatina è despiralizzata, come suggeriscono i corpi di Barr, ovvero i cromosomi X che nei mammiferi di sesso maschile sono presenti in copia unica, ma nelle femmine in due coppie, permettendo conseguentemente la produzione del doppio delle proteine; invece uno dei due cromosomi sessuali è spiralizzato costantemente già dalla fase embrionale.

Istone-acetiltransferasi

Se la cromatina risulta inizialmente spiralizzata, come è possibile che essa si despiralizzi momentaneamente?  

Per far ciò intervengono degli enzimi attivatori (più di 50 nei mammiferi), come l'istone-acetiltransferasi, il quale si attacca attraverso gruppi acetili (-COCH₃) agli istoni.

Il promotore delle cellule eucariote, a differenza di quello dei procarioti, è costituito da tre regioni differenti:

1. La prima regione è il TATA box (5' – TATAAA – 3'), sequenza che localizza il punto da cui la trascrizione potrebbe iniziare;
2. Un'altra regione, il sito di inizio della trascrizione, dove l'RNA polimerasi si inserisce per avviare la trascrizione, il quale sommato al TATA box costituisce il promotore basale (core promoter), a cui sono legati 5 fattori di trascrizione generali (GTF) per consentire l'attacco della RNA polimerasi. Si viene a formare così quello che è definito complesso di pre-inizio;
3. La terza regione è il sito degli elementi regolatori, formato da sequenze nucleotidiche denominate rispettivamente enhancer o silencer, a seconda della funzione (avvio o inibizione della trascrizione di un gene).

Spiegato ora com'è costituito un promoter eucariote, bisogna dire come avviene l'inizio del processo di trascrizione.

Un attivatore si lega ad un enhancer, favorendo a sua volta l'attacco di un fattore di trascrizione al TATA box e la conseguente formazione del complesso di pre-inizio.

Capita però alcune volte che l'enhancer si trovi lontano dalla sequenza promotrice, perciò interviene una proteina mediatrice (mediatore) che mette in comunicazione l'attivatore dell'enhancer con il complesso di pre-inizio.

Il controllo genico nei procarioti

Attualmente la trascrizione nei procarioti si basa su un modello chiamato operone, proposto dai biologi francesi François Jacob e Jacques Monod.

Françis Jacob

Jacques Lucien Monod

Secondo tale modello, il DNA è formato in successione da una sequenza promotrice dove si attacca la RNA polimerasi (promotore), da una sequenza che fa da aggancio per gli enzimi attivatori o i repressori (operatore), ed infine dai geni strutturali che codificano i futuri polipeptidi.

Gli attivatori o repressori (fattori di regolazione della trascrizione) possiedono dei siti di legame per delle molecole effettrici, le quali attaccandosi o staccandosi dal fattore danno il segnale di comando a questi enzimi, cioè se effettuare un controllo negativo (repressione) o uno positivo (induzione); le sequenze che codificano le proteine di regolazione si chiamano geni regolatori, le quali si possono trovare vicino all'operone o sparse per il cromosoma.

La capacità di un repressore di legarsi all'operone è data perciò dalla molecola effettrice, la quale è detta corepressore se lo attiva, altrimenti se lo disattiva si chiama induttore. Vediamo due esempi concreti sulla repressione:

Quando il livello di triptofano è alto, esso funge da molecola effettrice o meglio da corepressore, legandosi al repressore trp, inducendone la sua attivazione, il quale poi si lega all'operatore che blocca la trascrizione.

Invece, quando è presente il lattosio, si instaura un meccanismo di produzione dell'allolattosio, il quale funziona da molecola effettrice o meglio da induttore, cioè si lega al repressore, disattivandolo e facendolo staccare dall'operone del lattosio (lac). Di conseguenza la RNA polimerasi trascrive tre enzimi di seguito che serviranno per smontare il lattosio nei suoi due costituenti (l'enzima beta-galattosidasi, la beta-galattoside permeasi, e l'enzima transacetilasi).

Esistono comunque proteine indispensabili per la cellula, tanto che i geni che le codificano sono controllati con minore rigidità, essendo sempre attivi: essi sono chiamati geni costitutivi (housekeeping).

La regolazione genica

I geni, ovvero la porzione di DNA che codifica un polipeptide, hanno la capacità di attivarsi e disattivarsi all'interno della cellula, attraverso processi che fanno parte di quale controllo del genoma che è definito regolazione genica.

Il vantaggio è un minor dispendio di energia da parte della cellula di cui i geni ne fanno parte; ad esempio all'interno di un batterio di Escherichia coli, l'enzima beta-galattosidasi scinde la molecola del lattosio, disaccaride formato da glucosio e galattosio, solo se è presente lo zucchero, altrimenti la loro creazione risulta inutile.

L'enzima beta-galattosidasi

In altri casi, se la sostanza che gli enzimi fabbricano (esempio triptofano) è presente all'interno della cellula, allora questi si decompongono, altrimenti se il triptofano è assente, le proteine che eseguono la biosintesi per creare questo tipo di amminoacido sono indispensabili.

Triptofano

Nei procarioti in genere il controllo genico avviene per attivazione o disattivazione delle unità ereditarie, mentre negli eucarioti la faccenda è più complessa.

Lo zigote si divide ripetutamente per mitosi e citodieresi, originando molte cellule, le quali avranno lo stesso patrimonio genetico (genoma), ma differente corredo proteica (proteoma), avendo ognuna funzioni e strutture diverse.

Tutto questo è ben visibile nei globuli rossi ad esempio: infatti, allo stato embrionale, i globuli rossi sintetizzano un tipo di emoglobina maggiormente affine all'ossigeno, cosa che diminuisce allo stadio di feto tramite un secondo tipo di emoglobina e in breve tempo si producono catene polipeptidiche come nella fase adulta.
Perciò ogni cellula del nostro corpo contiene le sequenze di DNA per codificare tutti gli enzimi, ma sono attivate e disattivate in base al tipo di cellula.

Per dimostrare ciò, il biologo J. B. Gurdon condusse un esperimento, nel quale irradiò un ovulo

John Bertrand Gurdon

prelevatoda una rana femmina, distruggendo in seguito il suo nucleo mediante radiazioni ultraviolette; dopodiché prelevò il nucleo di una cellula intestinale di un girino e lo inserì nella cellula uovo priva di nucleo, così che quest'ultima diede origine ad una rana con le caratteristiche del girino donatore del nucleo.

Le mutazione geniche

Una mutazione è un cambiamento dei nucleotidi di una sequenza all'interno di un acido nucleico.

Quando sono presenti nei gameti o nelle cellule che li originano, esse si protrarranno anche alle generazioni successive, mentre le mutazioni che agiscono nelle cellule somatiche sono trasmesse alle cellule figlie per mitosi e citodieresi.

Le mutazioni in genere riguardano la sostituzione, aggiunta o perdita di un singolo nucleotide o di poche unità, e sono definite mutazioni puntiformi, le quali si presentano in modalità diverse:

1. Quando viene sostituita una base azotata, cambia l'amminoacido che è presente solitamente in una proteina, causando al polipeptide una mutazione di senso (missense mutation), come nell'anemia falciforme. La molecola difettosa di emoglobina che la caratterizza è formata da quattro catene polipeptidiche, due filamenti alfa e due beta. Le catene beta in una molecola di emoglobina normale contengono in un punto preciso una sequenza di acido glutammico (glu); mentre in un filamento beta delle cellule falciformi è presente la valina (val). Questa mutazione è avvenuta perché l'mRNA possiede la sequenza GUA (val) invece di GAA (glu), mentre nel filamento stampo del DNA da cui viene trascritto l'mRNA risulta essere GUG (val) invece delle sequenza GAG (glu).
2. Un altro tipo di mutazione che avviene per sostituzione di una base azotata è definita mutazione non senso (nonsense mutation), la quale consiste nella sostituzione di una sequenza nucleotidica normale con una di arresto, causando lo “stop” della sintesi proteica prima del tempo. Le conseguenze sono maggiormente gravi, come la distrofia muscolare di Duchenne, venendo a mancare la proteina distrofina (fondamentale per il tessuto muscolare).
3. Un terzo tipo di mutazione puntiforme è detta silente (silent mutation), nella quale la sostituzione di un nucleotide non comporta il cambiamento della proteina: infatti la tripletta AAA dell'mRNA cosi come la tripletta AAG codifica sempre l'amminoacido lisina (lys).
   Oltre alla sostituzione può avvenire la perdita (delezione) o aggiunta (inserimento) di un nucleotide, cambiando il modo di lettura dei nucleotidi, producendo spesso proteine nuove e non funzionanti.

Le mutazioni, viste macroscopicamente, possono essere spontanee o indotte.

Anche il processo di traduzione avviene in tre fasi successive

Il processo di traduzione o di sintesi proteica ha il compito di elaborare e decodificare il messaggio nucleotidico dell'mRNA nel linguaggio degli amminoacidi delle proteine.

Esso consiste in tre fasi principali:

1. la fase d'inizio comincia con l'attaccamento della subunità minore del ribosoma al filamento dell'RNA messaggero. In seguito il tRNA si attacca per mezzo dell'anticodone (solitamente 3'-UAC-5') complementare al primo codone dell'mRNA (conseguentemente 5'-AUG-3'), portando con sé l'amminoacido modificato della metionina, la formilmetionina (fMet). Dopodiché la subunità maggiore del ribosoma, formata da tre siti specifici, si attacca a quella minore, causando l'occupazione del sito P (polipeptide) del tRNA.
   
2. la fase di allungamento comporta l'attaccamento di un altro tRNA con anticodone complementare al secondo codone del RNA messaggero, occupando il sito A (amminoacile)
   della parte superiore del ribosoma. Si forma un legame peptidico fra i due amminoacidi, ricavando energia dal nucleotide GTP (guanosina trifosfato) del secondo RNA di trasporto. Poi l''mRNA, scorrendo in avanti, provoca lo spostamento del primo tRNA nel sito E (espulsione), il quale viene liberato, mentre il tRNA seguente slitta in P, dando lo spazio ad un terzo tRNA di insediarsi nel sito A, ripetendo l'operazione altre svariate volte.
   
3. la fase di terminazione determina l'arresto della sintesi proteica, a causa di un codone di arresto, il quale, non possedendo nessun tRNA complementare, accoglie una proteina detta fattore di rilascio, dissociando le subunità del ribosoma e rimuovendo la catena polipeptidica.
   

Ricorda!

I ribosomi possono sintetizzare e fabbricare polipeptidi contemporaneamente con stesso mRNA, e vengono chiamati polisomi o poliribosomi.

Le proteine prodotte, in base alle sequenza di amminoacidi che le caratterizzano (sequenza segnale), si dirigono nel citosol, e gran parte di esse entrano nel nucleo o nei mitocondri; altri proteine (enzimi digestivi e gli ormoni) vengono indirizzate attraverso l'apparato di Golgi dal reticolo endoplasmatico, nel quale le biomolecole vengono rielaborate e “impacchettate” in vescicole espulse fuori dalla cellula o in un compartimento cellulare.